抗艾滋病药物研究的新靶点

　　       艾滋病(AIDS)在全世界传播以来，给人类的健康和生命带来了巨大的威胁。目前临床使用的抗HIV感染药物主要为逆转录酶抑制剂和蛋白酶抑制剂，虽然已经出现以HIV穿入为靶点的穿入抑制剂(这类抑制剂主要以HIV进入宿主细胞过程各个环节所需的蛋白或趋化因子受体为靶点)、以整合酶为靶点的整合酶抑制剂和以聚合酶为靶点的聚合酶抑制剂，但大都还处于临床试验阶段。由于现在的抗HIV药物的毒副作用较大，而且HIV变异对药物产生的耐药性也日趋严重，所以开发新的药物结构类型、寻找新的药物作用机制和新的药物作用靶点成为了抗HIV感染研究的核心内容。

　　       1病毒自身生活周期所需的蛋白及其复合物

　　       HIV病毒感染宿主细胞是一个复杂的过程，包括吸附、穿入、脱壳、逆转录、整合、复制、转录、翻译、装配、成熟等各个阶段。针对病毒自身生活周期各个环节的研究，发现了一些抗HIV感染的新靶点，它们大部分是病毒自身生活周期所需的蛋白及其复合物，主要有以下几类：

　　       1.1Rev蛋白

　　       Rev蛋白(regulator of virion protein expression)是HIV-1转录过程中不可缺少的一种调控蛋白，由116个氨基酸残基组成，相对分子质量约19ku，是一种带正电荷的磷酸化蛋白质。它能使前病毒有选择地生成调节蛋白或病毒颗粒成分，通过调节HIV基因的有效表达，从而调控HIV-1的增殖。

　　       HIV-1的基因表达是一个复杂的过程。在基因表达的早期阶段，HIV－1的基因转录成mRNA，mRNA经多次剪接，生成短的转录物直接从细胞核运送至细胞质，翻译为Rev、Tat、Nef等蛋白；在基因表达的后期阶段，翻译出的少量的Rev蛋白进入细胞核中，与HIV中的一部分同Rev相关的碱基序列RRE(Rev-responsive element)结合，帮助HIV-1的mRNA不经过分裂，或只经过半分裂就能从细胞核输送到细胞质中，加速mRNA从细胞核向细胞质转运，同时降低它们的剪接程度，转译HIV增殖所需要的Gag、Pol、Env等结构蛋白。

　　       当Rev缺乏或者不能进入细胞核时，未剪接和部分剪接的mRNA将在核内完全降解，病毒增殖所需的各种蛋白质不能顺利合成，导致HIV-1的复制被阻断。所以抑制Rev蛋白，就可以抑制HIV的mRNA在细胞质内的积聚，使HIV增殖所需要的各种蛋白得不到合成，从而阻断HIV的增殖。

　　       目前已经有一些靶向作用于Rev蛋白介导的mRNA核质转运过程的抑制剂，如细霉素B(leptomycin B,LMB)、DB340、PKF0502638等，这些化合物靶向作用于核转运过程中Rev蛋白与其他物质的结合，干扰HIV mRNA核质转运过程，从而抑制病毒复制。

　　       1.2Tat蛋白

　　       Tat蛋白(transactivator of transcription)是一种含有106个氨基酸残基的蛋白质(HXB2毒株例外，含86个氨基酸残基)，在HIV-1的转录过程中起着关键的作用。

　　       HIV-1侵入宿主细胞后，在HIV-1逆转录酶的作用下合成双链DNA，病毒双链DNA在整合酶的作用下嵌入宿主细胞的DNA。在没有Tat蛋白的情况下，整合的前病毒DNA转录效率很低，只有短的转录物生成。当细胞质中的Tat蛋白转导进入细胞核后，与病毒新生RNA的反式激活因子效应区TAR(trans- activator response region)相互作用，激活病毒RNA的转录，使得转录效率提高几百倍，从而得以持续进行，生成完整的mRNA。

　　       目前研究的Tat蛋白抑制剂大部分直接靶向于Tat蛋白，如TDS、RBT550等。这些化合物能够使Tat的构象改变，无法形成与TAR结合的活性构象，从而抑制病毒转录的反式激活。

　　       1.3HIV-1的核壳体蛋白7

　　       成熟的HIV-1病毒中大约有2000个核壳体蛋白(nucleocapsid protein,NCp)。其中NCp7具有2个锌指结构，由72个氨基酸残基组成，在病毒的逆转录过程与整合过程都起到重要作用，近年来已成为备受关注的抗病毒药物研究的新作用靶点。

　　       在HIV-1的逆转录起始阶段，启动子与引物结合位点序列(primer binding site sequence, PBS)发生杂交，开始逆转录合成前病毒DNA。NCp7参与逆转录起始复合物的形成，能够使基因组RNA和启动子同时发生松动，有利于启动子与PBS发生杂交配对连接；在合成cDNA的过程中，NCp7能够解开8-12个核苷酸长度的双链序列，加速病毒RNA降解；逆转录复制时，RNA的缺口处及模板与模板的相互作用处能够发生非特异性复制，使复制停止并且可能导致模板裂解，而NCp7能够非常有效地减少这类复制错误的发生。

　　       在HIV-1整合过程中，在前病毒DNA合成的完成阶段，NCp7和整合酶(integrase, IN)一起连接到前病毒DNA，两者共同确保病毒DNA保持构象并且整合到宿主基因组中。新生成的DNA平均每5个碱基对连接1个NCp7分子，这种复合物能够有效防止新生成的前病毒DNA被细胞的核酸外切酶降解，有利于前病毒DNA的构型保持稳定。如果NCp7结构发生改变或者由于药物作用发生交联，NCp7就不能够结合到新生成的DNA外部，也不能够保护其不受细胞中核酸外切酶的水解，组装就会出现缺陷，致使不完整的病毒出芽或组装，释放出无感染力或低感染力的病毒。

　　       可以看出，NCp7对于基因组RNA的组装和完整病毒的生成具有相当重要的作用。目前已经设计合成出一些针对于此靶点的化合物，如吡啶烷酰基硫醚类化合物等。这些化合物的主要作用位点为NCp7的锌指结构，通过药物与NCp7作用排出锌指结构里的锌离子从而改变NCp7的结构，导致其丧失原有的功能，从而抑制HIV-1的复制。

　　       1.4HIV-1衣壳蛋白

　　       HIV核酸在宿主细胞内完成复制以后，要表达一系列蛋白，装配为成熟的病毒颗粒，才具有感染性。所以，病毒颗粒的成熟也成为了目前药物设计的新靶点。病毒出芽后，Gag蛋白水解释放出衣壳蛋白(capsid, CA)，并引发构象的改变，促使螺旋核样的衣壳粒子进行组装，这个过程称为病毒的成熟过程，目前对HIV成熟过程的研究主要集中在HIV的衣壳蛋白上。

　　       HIV-1衣壳蛋白由231个氨基酸组成，具有两个独立的折叠区域，在病毒的生命周期中的作用十分重要。体外病毒合成实验表明，HIV-1衣壳蛋白的突变能使病毒侵入能力变得很弱；HIV-1衣壳蛋白的组装缺陷时，核的稳定性也会随之改变，导致病毒复制能力减弱，并影响其逆转录过程。

　　       目前针对病毒成熟为靶点的抗HIV-1化合物主要有PA-457和CAP-1。其中PA-457作用于病毒复制的后期阶段，通过扰乱Gag蛋白水解过程而阻碍病毒核的成熟，对抑制衣壳蛋白前体(p25)向成熟衣壳蛋白(p24)的转化具有专属性。CAP -1能与HIV-1病毒衣壳蛋白N端部分的顶部相连，抑制衣壳的组装，从而抑制病毒的复制。

　　       2宿主细胞内源性抗病毒因子

　　       除了病毒生命周期中自身所需的蛋白及复合物外，在宿主细胞中也发现了一些具有抗病毒活性的内源性抗病毒因子，它们很有希望成为新一类的抗HIV感染药物。

　　       2.1载脂蛋白B mRNA编辑酶催化多肽样蛋白3G

　　       HIV-1病毒中vif基因编码的产物被命名为病毒感染性因子(viral infectivity factor, Vif)，是HIV感染所需要的调控蛋白。缺失vif基因的HIV株(HIV 1△vif)在体内不能复制，在体外虽可以正常复制并产生病毒颗粒，但其感染性是野生型的1‰以下。HIV 1△vif的病毒颗粒在形态学上也表现异常，在感染细胞中的逆转录过程以及病毒颗粒中的内源性逆转录都明显受损，因而不能感染靶细胞。

　　       有趣的是，HIV 1△vif在一些肿瘤细胞系可以顺利地进行复制。根据HIV 1△vif是否能够在其内复制可将细胞分为“允许细胞”(permissive cells)和“非允许细胞”(non-permissive cells)。非允许细胞包括原始T细胞和某些转染T细胞系如PM1，Hut78，CEM等。允许细胞包括非淋巴细胞系如HeLa细胞和一些肿瘤细胞系如SupT1，C8166，CEMss等。当非允许性细胞和允许性细胞融合时，杂合细胞的表型是非允许性的，能够抑制HIV 1△vif在其内复制。这些现象表明，非允许细胞中可能存在某种未知的抵抗HIV-1感染的内源性因子，这种内源性抗病毒因子可以被Vif拮抗。

　　       2002年，Sheehy等发现非允许性细胞中含有一种与Vif作用的特殊的胞嘧啶脱氨酶 载脂蛋白B mRNA编辑酶催化多肽样蛋白3G (apolipoprotein B messenger RNA-editing enzyme catalytic polypeptide-like 3G,，APOBEC3G)，证实了上述推测中抑制性因子的存在。APOBEC3G并不抑制HIV-1毒粒的产生，但却可以显著地、特异性地降低HIV 1△vif的感染力。研究表明，APOBEC3G在病毒组装时被大量包装进入HIV 1△vif病毒衣壳。在含有APOBEC3G的子代HIV 1△vif毒粒感染的反转录阶段，它能使新合成的病毒负链cDNA中的大量胞嘧啶(C)脱氨，形成尿嘧啶(U)，导致以负链为模板的cDNA正链大量鸟嘌呤(G)突变为腺嘌呤(A)，即产生G→A广泛的超突变。大量G→A超突变可造成病毒基因终止密码子出现的频率大大增加，使得HIV编码的蛋白功能丧失或降低，从而使病毒丧失活性。

　　       研究表明，Vif拮抗APOBEC3G的抗病毒活性主要是通过二者不可逆的结合及随后的快速降解来完成的。如果能开发阻断Vif与APOBEC3G的结合、干扰Vif介导的APOBEC3G降解、增强APOBEC3G活性的药物，将为HIV感染者的治疗开辟新的途径。

　　       2.2Trim5α

　　       2004年，美国的Sodroski研究小组在Nature杂志上发表研究报告称，在灵长类动物细胞中发现了一种可以抗HIV-1的蛋白质，研究证明属于三结构域蛋白三联基元(tripartite motif, Trim)家族成员，定义为Trim5α。

　　       一系列对灵长类动物及人Trim5α蛋白的研究表明，Trim5α蛋白是一种泛素连接酶(ubiquitin ligase)，通过促进对特异性病毒蛋白质的水解，达到抗病毒作用，在机体先天免疫中起着重要作用。HIV-1衣壳蛋白突变研究证实，病毒颗粒感染宿主细胞后需要精细的脱衣壳过程，才能完成进一步的逆转录和复制。Trim5α蛋白正是破坏了病毒的这个精细有序的去壳过程，抑制了HIV-1基因组RNA的脱衣壳蛋白作用，实现对HIV-1病毒的进入后限制(post-entry restriction)，进而阻断病毒在细胞内复制和形成有效的感染。但Trim5α蛋白的这种抑制作用具有特异性，即恒河猴的Trim5α蛋白可以有效抑制HIV-1病毒在细胞内的进一步增殖，但对SIV不起明显的抑制作用；相反，人的Trim5α蛋白可有效地抑制SIV，但对HIV-1抑制作用不大。因此，Trim5α可能在进化过程中形成了对物种交叉的逆转录病毒感染的限制。

　　       由于不同物种的Trim5α蛋白具有不同的抗病毒谱系，所以通过对不同物种的Trim5α蛋白及其特异性变异体的研究，可以在其他物种中找到新的抗特异病毒的蛋白质，从而达到抗HIV目的。

　　       3其他抗HIV-1感染的潜在靶标

　　       3.1Vpu和Vpr

　　       HIV-1病毒的辅助调节基因在病毒的复制周期表达，并编码4种辅助调节蛋白：Vif，Nef，Vpr (viral protein R)和Vpu(viral protein U)。其中Vpr可以促进病毒基因的表达，而Vpu主要是促进子代HIV-1病毒颗粒的产生，针对这两种辅助蛋白进行药物设计已经成为艾滋病研究的热点之一。

　　       Vpu蛋白是HIV-1病毒特有的辅助蛋白，它含有81个氨基酸残基，相对分子质量为16ku，它能通过几种不同的机制促进HIV-1病毒的装配和释放。Vpu蛋白在HIV-1感染过程能诱导CD4受体的快速降解，并调节HIV-1病毒Gag结构蛋白的前体(Pr55Gag)的细胞定位，影响病毒的装配与释放；Vpu蛋白还能通过抑制UBP蛋白和抑制TASK-1离子通道，促进新生病毒颗粒的释放；Vpu蛋白的TM区域与细胞膜结合，间接地改变细胞膜环境，通过离子通道作用促进病毒的释放。Vpu蛋白变异或其功能受到抑制时，HIV-1病毒颗粒的产生会明显减少。

　　       Vpr蛋白是保守性的vpr基因编码的碱性蛋白质，其单体由96个氨基酸残基组成，相对分子质量大约14ku，在HIV 1生命周期的晚期表达。Vpr蛋白组装进HIV-1颗粒后，主要以多聚体的形式存在于病毒颗粒的圆锥形核心，并与RNA紧密相连，在病毒的复制中发挥多种功能。它能参与逆转录过程的保真性调节，促进整合前复合物的核运输，影响细胞周期进程，诱导细胞凋亡，并对HIV长末端重复序列(LTR)、宿主基因转录激活具有调控作用。

　　Vpu与Vpr的多种作用与HIV-1发病机制密切相关，同时也表明它们参与了细胞的诸多生化过程随着研究的深入，会对Vpu与Vpr的作用及HIV 生命周期有更新的认识，并使Vpu与Vpr成为阐明细胞生命过程的有效工具，启发人们发现基于Vp与Vpr的新型抗HIV-1治疗途径。

　　       3.2病毒颗粒的释放

　　       HIV病毒在宿主细胞膜上包装自己的病毒颗粒，再进行出芽释放去感染其他的细胞。HIV病毒Gag蛋白的p6区域包含了高度保守的PTAP部位此部位与宿主细胞的TSG101蛋白结合，促使病毒出芽，对病毒的释放有着至关重要的作用。如果将TSG101基因敲除或使其过表达，病毒的出芽在晚期就会被抑制，从而阻止HIV感染其他细胞TSG101蛋白的这种影响病毒颗粒释放的功能，对于寻求新的有效的治疗HIV感染的方法,无疑是一个突破口。

　　       4结语

　　       由于目前尚无完全控制和清除HIV感染的有效治疗手段，所以如何提高机体自身免疫力和抗病毒能力，开发针对病毒不同生活周期、抑制细胞复制的新型药物，是目前治疗HIV感染的研究重点和发展方向。对上述新靶点的研究，为新型抗病毒药物的开发和机体天然免疫机制的研究开拓了新的方向，可能对未来的HIV及其他病毒性疾病的防治提供新的线索。