摘要

　　  超氧化物歧化酶是一种广泛存在于动物、植物、微生物中的金属酶,按其结合的金属离子可分为Fe2SOD、Mn2SOD、CuZn2SOD 三种,它们催化超氧阴离子自由基O·-2 发生歧化反应,从而清除O·-2 ,因而它能防御氧毒性,增强机体抗辐射损伤能力,防衰老,在一些肿瘤、炎症、自身免疫疾病等治疗中有良好疗效. 本文对SOD 的分布与定位,理化特性及结构,SOD 分子修饰与SOD 模拟酶,SOD 基因克隆与表达以及SOD 应用前景进行了综述.

　　 超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase EC1. 15. 1. 1 简称SOD) 是一种广泛存在于动植物、微生物中的金属酶,它催化超氧阴离子自由基O·-2 发生歧化反应,从而清除O·-2，自从Mann 和Keilin 于1938 年首次从牛红血球中分离出一种兰色铜蛋白(最初定名为血铜蛋白Hemocuprein) 并由McCord 和Fridovich (1969) 根据其酶活特性定名为超氧化物歧化酶以来,人们对它的研究不断深入. 近年来的研究表明SOD 在维持生物体内O· -2 的产生与消除的动态平衡中起重要作用,它能防御氧毒性,增强机体抗辐射损伤能力,还可预防衰老,在一些疾病如肿瘤、炎症及自身免疫疾病等的治疗中有良好的疗效. 目前国内对SOD 的研究主要集中在应用及与应用直接相关的基础理论的研究上. SOD 已进入化妆品、食品、医药等领域,无可置疑,SOD 的应用与开发将有不可估量的前景.

　　   SOD 按其结合的金属离子,可分为Fe2SOD、Mn2SOD、CuZn2SOD 三种,前两种性质相似,在蛋白质一级结构、空间结构、分子量、光谱性质及对不同抑制剂的敏感等方面与后者差别较大. 早些时候认为Fe2SOD 主要存在原核细胞中,随实验手段的改进,现已在拘杞、何首乌等越来越多的维管植物中发现Fe2SOD 的在.Mn2SOD 在原核细胞和真核细胞中都存在,CuZn2SOD 主要存在于真核细胞中,由此引出进化方面的研究. 一般认为Fe 型、Mn 型SOD 很早起源于一个共同的祖先———光合细菌,而CuZn2SOD是在以后的发展中单独进化而成. 本文就SOD 的分布与定位,理化特性及结构,SOD 分子修饰与SOD模拟酶,SOD 基因克隆与表达以及SOD 应用前景进行综述. 阐述.

　　     1 SOD 的分布及定位

　　SOD 是生物体防御氧毒性的关键性防线,人们最初认为SOD 只存在于好氧生物和耐氧生物中,而专性厌氧生物中不存在. 1973 年Bell 发现在厌氧菌硫酸还原菌( Sulfatereducing bacteria) 中有SOD 的活力,以后SOD 活力在多种厌氧菌中被发现,只是活力较低,不易检测. 专性厌氧菌SOD 可以在细菌偶尔暴露于低浓度氧环境中时抵抗氧毒性,比如专性厌氧菌从一个无氧环境到另一个低氧环境过程中就需要这种保护.真菌里一般含Mn2SOD CuZn2SOD. 大多数真核藻类在其叶绿体基质中存在Fe2SOD ,类囊体膜上结合着Mn2SOD ,这与原核蓝细菌相似,这些研究结果都支持藻类叶绿体起源于蓝细菌内共生的假说. 大多数藻类不含CuZn2SOD. 蓝藻中极大螺旋藻、钝顶螺旋藻和盐泽螺旋藻中含Fe2SOD ,绿藻中不含CuZn2SOD 而含Fe2SOD 和Mn2SOD ,轮藻中含Fe2SOD、Mn2SOD 和CuZn2SOD 三种类型,提示轮藻可能是绿藻向高等植物进化的过渡形式.
　　       植物细胞中的Fe2SOD 主要存在于叶绿体中. 罗广华等用大豆下胚轴为材料证明SOD 活性主要存在于细胞质中,约占细胞内SOD 的87. 3 % ,其次分布于线粒体中,这部分约占6. 8 %—7. 2 %. 实验又表明细胞质的SOD 以CuZn2SOD 为主,占胞质SOD 的86 % ,线粒体SOD 主要是Mn2SOD ,占线粒体全部SOD 的74 % —76 %. 王爱国、罗广华等将线粒体分离为外膜、内膜、基质、膜间溶质4 个部分,进一步证明大豆下胚轴线粒体内SOD 主要在基质(80 % —97 %) ,且验证为Mn2SOD ,其次分布在膜间溶质(16 % —17 %) ,且验证为CuZn2SOD. 线粒体的内膜,一侧为基质,另一侧为膜间溶质,内膜呼吸链上产生的O· -2 能迅速被两侧SOD 清除 . 可见植物线粒体在正常情况下,自身对O· -2 的防卫能力已经相当完善.大多数原始的无脊椎动物细胞中都存在CuZn2SOD ,这表明在动物进化早期就有这类SOD. 脊椎动物一般含CuZn2SOD 和Mn2SOD ,人、鼠、猪、牛等红细胞和肝细胞中含CuZn2SOD ,而从人和动物肝细胞中也纯化了Mn2SOD. CuZn2SOD 主要存在于细胞质,也存在于线粒体内外膜之间,Mn2SOD 一般存在于线粒体基质中. SOD 是细胞内酶,但在人血清中分离到一种独特的细胞外CuZn2SOD( Ec2SOD extracellular su2peroxide dismutase) ,不同于一般的SOD ,这种SOD 已在多种动物细胞里发现. 从进化上来说CuZn2SOD 是真核生物酶,但在某些细菌如与鱼类共生的发光杆菌( P. leiognathi) 中含有CuZn2SOD .

　　2 SOD 的理化特性及结构
　　近年来不少学者对SOD 的理化特性、金属离子含量、氨基酸顺序、分子结构及稳定性等进行了系统的研究. 这些研究表明SOD 属于酸性蛋白,对pH、热和蛋白酶比一般酶稳定. Parker 等人根据对多种SOD 初级结构及X2射线衍射研究提出了区别Mn2SOD 与Fe2SOD 的氨基酸残基. Joan 等人指出不同来源的CuZn2SOD 具有较高的同源性,它们的理化性质也很相似,据推测它们可能由同一原始酶进化而来.不同来源的Mn2SOD 或Fe2SOD 也具有相似的理化特性和较高的同源性,它们可能由另一原始酶进化而成. 这些研究表明不同来源的同一类SOD 显示出进化上的保守性和理化特性的相似性,Fe2SOD、Mn2SOD和CuZn2SOD 三种SOD 的主要理化特性详见表1.SOD 所含的金属离子对SOD 的酶活性、分子的初级结构和三级结构具有重要作用,根据SOD 对CN- 或H2O2 等的敏感程度很容易区分上述三类SOD. 生命体系在进化过程中使SOD 结构逐步严密,至少通过三条途径确保其消除O·-2 自由基功能的顺利发挥. 其一,采取金属辅基形式的多样性,这样一旦某种SOD 的合成由于金属辅基缺乏而受阻时就可以另一种SOD 来补偿. 如葡孢霉在培养介质中Cu 少而限制CuZn2SOD 合成时,线粒体Mn2SOD 合成水平升高,使细胞内总的SOD 水平不变;其二,在进化上高度保守、防止发生变异;其三,在与催化活性直接有关部位上表现出高度的结构同一性,以利于催化功能的顺利进行. 由此可见,生物大分子之一的酶在其结构和功能上是何等的高度统一.

　　3 SOD 的分子修饰与SOD 模拟酶
　SOD 作为药用酶用于临床受以下因素的影响:半衰期短,通常只有6 —10 分钟;分子量大,不易透过细胞膜;抗原性;用于口服,易被旦白酶水解等. 所以对SOD 分子进行改造显得十分必要. 近年来不少学者对SOD 分子修饰及模拟酶进行了研究对SOD 分子修饰改造的途径主要有: ①对SOD 氨基酸残基进行化学修饰. 对SOD 来说,由于希望修饰的SOD 仍能保持最大活性,主要应对非活性部位进行修饰. ②用水溶性大分子(如聚乙二醇、聚蔗糖、右旋糖酐、聚烯属烃基氧化物等) 对SOD 进行共价修饰. ③对SOD 进行酶切修饰. 由于SOD 作用底物O· -2很小,SOD 酶活中心也小,可以设想通过酶切除去SOD 分子的部分肽段后仍保留其活性,以达到降低其分子量和抗原性的目的. 据文献报道,经不同手段修饰过的酶,不仅能保留天然酶活,而且在耐热、耐pH和抗蛋白酶水解等方面优于天然SOD .随着人们对SOD 越来越重视,近年来一些有机化学家和生物化学家协作,也加入到SOD 的研究行列,他们开始进行人工有机合成SOD 模拟酶,并取得可喜的结果.

　　4 SOD 基因克隆和表达
随着人们对SOD 的广泛深入的研究,近年来一些分子遗传学家开始对SOD 基因分离、核苷酸序列、基因克隆表达进行研究. 下面仅举几个例子评述这方面的研究进展.TaKao 等人发现H. halobium 的光裂合酶基因的312侧翼区域含有一个SOD 基因,描述了该基因的完整核苷酸序列,并证明SOD 基因和光裂合酶基因在该菌中是共转录的. Hallewell 等人报道人的CuZn2SOD 的cDNA 的核苷酸序列、分子克隆和用Tacl 启动了指导其在大肠杆菌中的高效表达. 他们对500 个克隆样品的分析结果表明克隆子能合成5 %或更多的可溶性蛋白为SOD. 他们还研究了人的CuZn2SOD基因在酵母菌中的表达和N2乙酰化作用. 他们利用酵母甘油醛磷酸脱氢酶启动了指导人的SOD 基因在酵母菌中高效表达,产生人的CuZn2SOD 是可溶的、具正常的酶比活以及对铜和锌表现低水平抗性. 酵
母产生的人的SOD 在其N2末端乙酰化,它与人血红细胞CuZn2SOD 在理化等特性上没有区别. 相反,细菌中表达产生的人的SOD 不能乙酰化,酵母菌自身的CuZn2SOD 也不能乙酰化. 由此可见用酵母表达生产人的SOD 可能是最有应用前途的.Brehm 等人把Stearothermophilus B 的Mn2SOD 基因克隆进大肠杆菌,对它的完整氨基酸序列进行了测定. 他们证实除翻译后粘连的N2末端甲硫氨酸残基外,预测的氨基酸序列与先前测定的氨基酸序列完全相同. 重组体Mn2SOD 在大肠杆菌中的高效表达,产生49 %的可溶性蛋白为SOD. Chembers 等人已将B. caldotenax(BG) 的Mn2SOD 基因克隆到大肠杆菌并进行了序列分析. 他们指出该基因的编码的区域内有21 个核苷酸与以前报道的B. stearothermophius (BS) 的SOD 基因同一编码区域内的核苷序列不同,BC 的Mn2SOD 在大肠杆菌中能高效表达产生40 %的可溶性蛋白为SOD.
　　5 SOD 的应用前景
　　5. 1 药物
　　SOD 是一种新型的抗炎症药,尤其对关节炎和类风湿关节炎有明显疗效,根据SOD 作用机制和毒性试验,它对治疗因O·-2 引起的各种疾病都有一定的疗效[1 ] . 为此,SOD 可作为抗衰老、抗炎症、自身免疫疾病患者广泛应用的医药品. 此外,SOD 对治疗贝切特氏症、心肌梗塞等血虚性心脏病、胶原病、新生儿呼吸困难综合症、防御放射性伤害等也可望有效. 近年来美、日、德、英国等对SOD 作为药品开发应用进行了一系列研究和临床试验,现将几个典型的例子列于表2.

　5. 2 添加剂
　　据悉,国外不少高级化妆品都添加SOD ,国内也有数家工厂或公司在开发和生产SOD 化妆品,如大宝SOD 密,康妮SOD、SOD 康舒达霜剂等. SOD 作为化妆品添加剂主要有三个优点: ①有明显的防晒效果,光照使皮肤变黑的主要原因是氧自由基损害,SOD 可以有效防止皮肤受电离辐射(特别是紫外线) 的损伤,从而起防晒效果; ②可防皮肤衰老,阻止紫褐质(老年斑) 的形成; ③有明显的抗炎效果,对防治皮肤病有一定效果. 当然,至今仍有人对SOD 能否透过皮肤及其实际效果持怀疑态度,对这些问题还待于进一步研究. 国外把SOD 作为食品添加剂的例子是加在口香糖和饮料中. 我国贵州农学院已开发出刺梨SOD 饮料. SOD 及修饰过的SOD 还可作为外用药膏、眼药及牙膏等的添加剂.
　　5. 3 生化试剂
　　国外已有数家公司如Sigma 公司等出售SOD 试剂[6] . 国内也有厂家批量生产SOD 试剂,如中科院上海生化所东风试剂厂、天津血液研究所、南京建成生物工程研究所等. 此外,SOD 有可能作为某些疾病的探针,如郭彦等人认为脑瘤组织线粒体Mn2SOD 降低是转化细胞的可靠生化指标之一,并可作为评估脑瘤分化程度的参考.
　 综上所述,国外对SOD 进行了一系列的基础、应用开发和临床试验. 相比之下,国内对SOD 的研究起步较晚,尽管有不少单位在进行SOD 的研究,但主要是分离纯化及性质等方面的研究,如吴国荣等关于植物药SOD 活性及某些性质的研究,报导23 种植物药SOD 活性、同工酶谱带及SOD 类型,为深入开发植物药提供参考等至于SOD 基因克隆和表达方面的研究,至今很少有报道.可以预言,随着人们对SOD 更广泛深入的研究,不同类型SOD、SOD 修饰物及人工有机合成SOD 模拟酶将在医疗、保健、食品、农业增产等方面发挥出更大的作用.